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微观世界

    显微镜下的人文与对象显现出来的世界,对于人们来说似乎有点熟悉又有点陌生,借助显微镜来调查或观察小对象的结构或损害情况,这些事务众所皆知,观察对象的大小,已从毫米、微米到奈米,回首这段历程真是梦幻到极点了。而显微镜的型态亦有很多种,从光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、扫描探针显微镜等,进步不只是神速,带动的科学与产业(图1)更是令人刮目相看。

 

1慨论

    显微镜适用于放大肉眼无法辨识之微小物体的图像,一般运用于对生物、医药、微观粒子等观测。在显微镜上透过目镜十字坐标线,可做样品大小之测量,亦可做样品细部结构之叙述,例如节距、节径、外径、牙角及牙形等,金相或任何样品表面晶态等等,并可加装附属备件来执行影像储存与比对,或其他文本文件、图像文件等。

     显微镜可分为两种类型,最常见也是第一个问世的光学显微镜,是使用可见光谱等光源,通过样品以生成影像,另一种是电子显微镜,其创建影像使用光束或电子或夸,扫描图像或一小段观察距离,探针样品表面进行交互的方式。

2历史

     类似镜头的叙述可追朔到四千年前,但真正引起光学回响,是在公元前五世纪,古罗马哲学家、政治家辛尼加Lucius Annaeus Seneca (c. 4 BC – AD 65),提到透过充填满水的球体来观察事物,光线通过球体产生折射,影像再聚于眼睛,愈近影像愈大,但太近样品反而会模糊。最早的简单显微镜,是在13世纪,其实他就是以放大光学影像镜头为工具,使用有限放大倍数的单透镜。

    显微镜的命名是伽利略德国好友法勃Giovanni Faber (1574 - 1629)所为,他是梵蒂冈天主教教皇御用皇家植物园顾问,1609年与伽利略合作组合一台复合式显微镜命名为occhiolino,为小眼睛之义,1624法勃自组一台显微镜献给意大利薛希王子Federico Cesi (1585 – 1630 ), 来年他以希腊文来命名, μικρόν (micron)是微小之义,而σκοπεῖν(skopein)则是注视。同年1625年伽利略将其复合式显微镜命名为Accademia dei Lincei。

2.1纠缠不清的早期显微镜史

    复合显微镜最早纪录是荷兰的杰森Zacharias Janssen (1585 - 1632),在1590至1618年间杰森父子眼镜制造商人所发明,但其外观就像天文望远镜,是两镜头或更多所构成,所以有争论是因另一位荷兰眼镜制造商利伯希Hans Lippershey (1570 - 1619),在1608年十月向荷兰政府提出第一位该装置的已知专利,但被质疑与德国天文学家马吕斯Simon Marius (1573 - 1625),在1608年法兰克福国际天文展览向荷兰某制造商所购得,几乎一模一样的款式,后来追踪查访才知可能是杰森所为,但当时均由杰森之子来应答,有时说是他们父子所为,有时又是父亲独自发明,是显微镜还是望远镜也不得其解。

    除此之外另一位荷兰发明家德瑞贝尔Corneilis Jacobszoon Drebbel (1572 -1633)也是历史学家笔下的传奇人物,德瑞贝尔最著名就是1620年发明潜水艇,及多项管控、量测、光学与化学产品,他还开发一部自动精密镜片磨床,而有关德瑞贝尔与复合显微镜的传说是在1621年,当时他在英国白金汉公爵工作,该装置最早买主是荷兰驻英大使伯瑞尔Willem de Boreel (1591 - 1668),当时描述仪器长约18英吋直径2英寸,三个黄铜管筒两个凸透镜所构成。德瑞贝尔也曾为意大利天文学家伽利略,制作了一台天文望远镜,1610年伽利略发现当焦距不调整时,该仪器可以观察小对象,伽利略的好友法勒在命名显微镜时,有关注视或看的用词 σκοπεν ,该字大部分是使用于望远镜学的用词,该字另一写法是Lincei。

2.2 定义与使用运筹

    显微镜发明之前,透镜能显现的效果只是放大倍数,目标不是近在眼前,就是远在天边,荷兰的发明家除了发明物之外就是效率等争论如此而已。意大利天文学家伽利略Galileo Galilei (1564 – 1642,图2),是第一位使用显微镜观察昆虫的科学家,对于昆虫复眼的描述非常细腻,但这种双透镜的复合式显微镜因技术上关系,镜头其实算是大的,所以预观察太细微的标的物会很模糊,也因伽利略曾使用显微镜来观测动植物,所以伽利略被列为显微镜发明人之一。

 

    第二位是荷兰亚麻织品商人列文虎克Antonie Philips van Leeuwenhoek (1632 – 1723,图3),自已磨高质量高倍数透镜并组装简单显微镜,以金属板上装上透镜,并装上一排螺丝钉带动一根指针,待观察的对象就放在指针上,透镜与对象的距离以螺丝钉来细微调整,起先描述不少许多肉眼无法观察的小动植物,包括血球与精虫等,1674年至1676年研究细菌及原生动物,1683年在英国皇家学会「哲学学报」上,发行他的观察纪录「小动物」。这些图像之细腻出乎大众意料之外,虽是简易显微镜,却是复合显微镜无法达到的解析能力,直到约150年后复合显微镜解决相关光学问题。小动物拉丁文animalcules,英文microorganisms成为后世微生物学microbiology名称来源。列文虎克未出书立言,只留下观察图鉴,当时的小动物被定义为非细胞生物,包括细菌、精虫、血球等,事实上他的观察还包刮了多细胞器官,如肌肉纤维细胞,微血管细胞等。

    英国自然学家胡克Robert Hook (1635 – 1703)利用装在纸茼或木管的两片透镜来观察事物,1665年发行观察结果报告「显微图鉴」(图4)。英国皇家学会会员意大利解剖学家马尔皮吉Marcello Malpighi (1628 – 1694,图5),在1661年出版有关毛细血管著作,「血液从动脉经微血管到静脉」,使得哈维的血液循环更为完备,解剖学也因而进入显微解剖学或组织学、细胞学等等。

2.3精益求精

    由于复合式显微镜光学的有些问题未能解决,色差是其中一个很重要因素,色差乃是颜色与波长的光线,透过透镜折射角度不同而产生,这些模糊不清又有色晕的现象,一直是显微镜刚开发时无法突破的问题。在球面上透镜边缘比中心折光更大,在使用望远镜时,人们有意识到使用折射角度不同的两种透镜可减少色差问题,1824年间英国物理学及显微镜家李斯特Joseph Jackson Lister (1786 - 1869),就研发出来无色差显微镜,李斯特是酒商,委托友人生产该显微镜,则是William Tulley光学仪器公司,1830年将他的研究心得报告定名为「无色差玻片应用于望远镜与显微镜」,原先是预发表于所参予的英国皇家学会,但并没发表而是其子英国著名外科医生李斯特Joseph Lister (1827 - 1912),发表于他当任会长的英国皇家显微镜学会,英国邮政发行的英国皇家显微镜学会150周年纪念邮票中(图6),红血球的研究就是老李斯特被揽入英国皇家学会院士的原因。也因其尊翁的重大突破,显微镜下生物学的发展更加蓬勃,显微镜学也更热络。

    1850年美国化学家李德尔John Leonard Riddell (1807 - 1865),在1836年担任杜兰大学(旧名路易斯安那州立医学院)化学教授时,就潜心于显微镜的研究,1850年承担美国霍乱流行病疫情调查,他使用一台双眼显微镜来作相关作业,双目镜单物镜首次出现,也是第一次以显微镜来作疫情管控工具。1880年德国病理学细菌学家艾博斯Karl Joseph Eberth (1835 – 1926,图7),发现引起伤寒的是杆菌,1884年病理学家卡菲基 George Theodor August Gaffky (1850 -1918)证实了伤寒杆菌,当时命名为艾博斯菌或称卡菲基艾博斯菌,在当时微生物学盛行时,显微镜的角色显而易见,当时这种以发现者来命名也屡见不鲜,直到国际微生物学会成立,才有统一命名机制,图8是荷兰微生物学会成立百周年。

 

2.4油浸透镜的发明

    德国物理学家阿贝Ernst Karl Abbe (1840 – 1905,图9),在1880年发明了油浸接物镜,使显微镜可放大二千倍,使用雪松木油滴于含样品的载玻片上,然后把高倍的物镜放下,并使物镜雪松木油及玻片等结合于适当的位置,光线由高密度的介质进入低密度介质,会产生折射作用,样品与透镜及居间的油滴,其折射角必然大于透镜与样品。聚焦距离因而更缩短,放大倍数也因而加大许多。使得细菌学的发展更蓬勃,物镜也由此从单颗到双颗及三颗,在蔡司光学博物馆收藏品中有一台1873年生产的显微镜,物镜只有二颗(图10)。

 

3光学显微镜optical microscopy

    光学显微镜是最早的显微镜设计发明,从观察记录需描画到通过光敏感相机来生成显影图像。知名德国光学系统制造商蔡司股份有限公司 Carl Zeiss AG,早期由创办人蔡司Carl Zeiss (1816 – 1888,图十一)在德国中部耶拿所建立,1846年创立时称为蔡司工作坊,当时显微镜是手工和艺术制造工业,蔡司的经营采利润分享制,但生产量一直未能突破,工匠质量不符要求就由蔡司亲自销毁,建厂时第一位工匠是罗伯August Löber (1830 – 1912),但当时生产是整个行程都是一个人所承揽,生产量自然不高,显微镜成品几乎是贵族的玩物,德国植物学家施莱登Matthias Jakob Schleiden (1804 – 1881) (细胞学说创立者之一),是蔡司工作坊的顾问,提议把生产线集中于显微镜,并引入另一位植物学家与显微镜学家迪培尔Georg Heinrich Leopold Dippel (1827 -1914),显微镜从简单的一个目镜与一个物镜,到可接二个或三个物镜,蔡司本是机械师非透镜师,在工业革命时秉持他的高水平品管要求,自有其道理所在,显微镜学不仅是以观察为主,蔡司开始寻求光学等物理学方面的佼佼者,包括阿贝与世代从事光学玻璃的德国化学家史考特Friedrich Otto Schott (1851 – 1935)。蔡司最为人们所津津乐道的是他在显微镜生产工业上的贡献,他坚持理念与目标前进,虽然完成艰巨任务不是他本人,但他用才之道与丝毫不自私的分享企业财务、理想、远景,给每一位愿意付出的,也因此在众志成城群策群力之下,不仅仅是蔡司公司(图十二),显微镜生产工业及科学之发展,得以稳定快速发展。

3.1传统光学显微镜traditional optical microscopy

    最常见也是最简单的单透镜光学显微镜(图十三)是双重凸透镜及短焦距,双重凸透镜可放大15倍,复合显微镜比简单透镜多使用二个透镜,一个物镜透镜和目镜透镜,提供更巨大的放大可能性,放大倍数取决于二个透镜的焦距,起初制造过程也几乎如出一辙,但经不断演进与研发,及配件的增加与实用性,使得显微镜学更日愈成长。

  从邮品中来探索显微镜发展史,可以发现它可以连结到灯光的发展史,以及在追求显微镜的适用性时,与科学发展史都有很微妙的关系存在。从伽利略的短小型天文望远镜,与胡克的显微镜是没有很大的差异,在佛伦斯博物馆中的伽利略亲手制造的小型天文望远镜(图14),在当时除了连接目镜与物镜的镜茼的长度差别外,其他并无显著差别(图15)。

3.1.1镜座与镜臂

  镜座与镜臂(图16),1790年生产)的出现,是便于使用者能专心于所欲于观察的事物,不必费心于固定镜茼,随着科技技术研发的需求,显微镜的配件也日渐增多,此部分虽无科学数据以为依据,但依然可以看出演化之沿革(图十七),最为显著就是材质与实用性。

3.1.2照明illumination

  早期的显微镜光源有气体灯、镜子或其他原始光源照明,如此之光源易造成照明不均匀。1791年法国工程师莱彭Philippe le Bon (1767 - 1804)发明了煤气灯,当时称之为是以煤的灵魂藉由蜡烛火焰点燃更光明。在东德1980年发行的蔡司光学博物馆收藏品中,就有此类显微镜,面值20芬妮的是英国Huntley公司1740年所生产,在烛台架后面很巧妙的隐藏了煤气管(图18),而面值25芬妮的是法国Magny公司1751年所生产,在镜座上也有煤气灯罩与煤气管线,其年度都早于正式官方验证年度,沿革却很合乎逻辑(图19九)。但此种气体稳定度并不好,所以大部分均是以镜子反射光来做光源(图20)。

 

  1879年爱迪生Thomas Alva Edison (1847 - 1931)发明了电灯。蔡司公司任职的德国物理学家柯勒August Karl Johann Valentin Köhler (1866 – 1948),在1893年发明了柯勒照明,解决了之前光照不均,甚至于灯泡灯丝出现于样品图像中等问题及局限,柯勒照明设计原理广泛运用于传统与现代光学显微镜(图二十一)。照明的方法有透射型与反射型二种,透射型是应用照明通过透明物体打光照明,反射型式以物质上方打光到样品上(图22),有关光源的分类还有暗视野、相位差、偏光、干涉相位差、荧光等。

3.1.3聚光器condenser

  聚光器是一种光学透镜,他将散光从光源平行或聚光束以照亮样品。显微镜学中并行的照明称为柯勒照明,凝聚照明常被称为临界光照。聚光器位于光源之上和样品之下,作用是从光源中收集光线,并将集中到一个照亮标本的锥形光中。聚光器的概念适用于各种光学变换的辐射,如电子显微镜、中子辐射和同步辐射光学等。

    第一次出现聚光器是在胡克的显微图鉴中,书中说明以水球体与一个平凸透镜组合,来增加解析能力,英国显微镜学家李斯特对聚光器的需求如饥如渴,也在1837年引用法国生物学杜杰丁Félix Dujardin (1801- 1860)的聚光器,这是平凸或双凸透镜或组合式但无销色差,直到微生物学家科赫向德国蔡司公司抱怨,1870年物理学家阿贝发明了阿贝聚光器,他可以消除色差等缺陷。阿贝聚光器可控制样品与光源的距离,还有虹膜类型膜片,可控制光柱直径。聚光器起先几乎与载物台连结在一起,阿贝聚光器出现后就不一定了,因为它是可调式(图二十三)。东德发行的蔡司光学博物馆收藏品中,面额35芬妮为意大利摩德纳Amici公司1845年生产,就可见杜杰丁聚光器(图24)。

3.1.4载物台stage

    使用显微镜来研究时,由于标本图像高度扩大化且倒置,用手来操作样品观察是困难,故预在高倍视野中观察一定数量视野,唯有以可承载及中间可透光的载物台不可。在载物台上可承制光标尺,上下左右定位疑惑标本位置。从邮品去追踪载物台的发展,从1981年西德发行的附捐邮票早期光学仪器中,有一枚是1860年生产的双目镜显微镜(图25),载物台呈圆形在后方有两颗螺丝,应该是固定样品的要件,而在日本发行的北里紫三郎(1853 – 1931)诞辰150周年纪念票中(图26),这台显微镜的载物台亦是圆形,但显然并无任何固定样品的零件,这不是重点,很显然地可看见载玻片是被置于聚光器的上方,所以两者应该是一样的位置。葡萄牙1999年发行的医学名人,其中细菌学家佩斯达纳Luís da Câmara Pestana (1863 - 1899) (图27),身旁的显微镜就较引人注目,尤其是载物台的设计,堪称是该年代的先锋,样品夹是可调式。

3.1.5目镜与物镜镜头eyepiece lens and object lens

 最早开发透镜光学数理理论的是荷兰物理学家惠更斯Christiaan Huygens (1629 - 1695),在1690年的论文中首次以数学公式与科学方法说明光波,基本上光速是有限的,原理是运动学范围主要限于几何光学,但不是现今的物理光学,惠更斯开发二种无色差光学透镜,使得天文学与显微镜发展更顺畅,此类目镜目前依然在制造使用。

 德国显微镜学家阿贝奠定了现代光学的基础,开发了许多光学仪器,1872发表发光物体的成像定律(图28),1874年论文「对显微镜的理论与微观视觉性质的贡献」,指出显微镜的分辨率与孔径成反比,1886年发明了一种比当时的消色差透镜更优的复消色差透镜apochromatic lens,他既可消除主色失真又可避免二次色差的显微镜透镜,此产品也因而被列为其企业形象产品(图29)。

  

    特殊专业显微镜为了专业需求会使用特殊镜头,研究岩相学时会使用尼可棱镜,这是苏格兰地理学家尼可William Nicol (1770 - 1851)所发明,当光线穿越标本尼可棱镜或分析仪,确定光的极化导致样品可被测量和估计矿物组成分光的极化变化(图三十)。

    在机台组合构造方面,目镜与物镜藉由镜茼而连结,起先是一对一或二对一,再一对二,到一对三或二对三或更多时,物镜转盘就出现了。

3.2紫外线显微镜 ultraviolet microscopy

     紫外线显微镜的发展,是由德国蔡司光学公司的柯勒与罗尔Moritz von Rohr (1868 – 1940)所研发,由于玻璃会吸收紫外线,所以采用了昂贵的石英来做光学透镜。

3.3相位差显微镜 Phase contrast microscopy

    相位差显微镜广泛应用于生物科学研究上,药物生理学、物理化学、生物化学等领域均是不可或缺的,亦可测出样品之折射率,一般光学显微镜之解析能力为200µ,相位差显微镜可择达5µ。

    德国数学家赛德尔Philipp Ludwig von Seidel (1821 – 1896),在1857年第一位将单色光学相差,分解为五种相差,称之为赛德尔相差。荷兰物理学家泽尼克Frits Zernike (1888 – 1966,图31),因发明相位差显微镜而获得1953年诺贝尔物理学奖。1930年泽尼克研究光谱,发现在主线与衍生线有相差近90度,他将这些现象运用于显微镜透镜上,研发出称之为相位对比技术。1938年出版的泛希特泽尼克定理,是依据1934年荷兰物理学家泛希特Pieter Hendrik van Cittert (1889 - 1959),所发行的相干理论再简化与实用化,研究的是单色扩展广元广场的空间相干性,在一定条件下,一个远距离的非相干源共有相干方程的传里叶变换,等于他的复合能见度。在光学成像系统上,1960年泽尼克多项式正交圆来解决像差这个问题,则以奇多项与偶多项正交圆交叉处理,相关影像折射的设计程序被广泛应用设计于光学设计、光学测量和图像分析上。1952年波兰物理学家诺曼斯基Georges Jerzy Nomarski (1919 – 1997),发明另一种微分干涉造影理论与微分干涉造影显微镜,亦可使用于研究活体生物标本及不染色样品。

3.4荧光显微镜fluorescence microscopy

 阿贝(1873)以及发现氩的英国物理学家瑞利(1896) John William Strutt Rayleigh (1842 - 1919) (1904年诺贝尔物理奖得主,图三十二),分别于19世纪末以公式来谈论显微镜的「衍射极限」,简而言之就是在可见光之下,显微镜的分辨率不可能解决一个结构两个元素,间距离的一半波长在横向平面,甚至分开纵向平面。为解决超解析显微镜的难题,科学家一直以远场与近场来处理所谓的阿贝极限。2014年诺贝尔化学奖颁发给美国物理学家贝齐格Robert Eric Betzig (1960 -,图三十三),美国物理化学家穆尔纳尔 William Esco Moerner (1953 -,图三十四 ),及德国物理学家希尔Stefan Walter Hell(1962 -,图三十五),奖励他们发展超解析荧光显微镜,使光学显微镜解析力可由微米进入奈米的境界。他们可以看到分子如何在大脑神经细胞之间产生运作,他们可以跟踪帕金森氏症,阿茨海默症和亨廷顿症的蛋白质,科学家们能够在微小的分子细节中研究活细胞间分子形态与运转。贝齐格1989年在AT&T贝尔实验室半导体物理研究部工作,1992年获麦克米兰奖William L. McMillan (1936 – 1984) award后,在穆尔纳尔研究启发下,成为第一个在室温下对单一荧光分子进行成像的人。荧光显微镜的历史并不长,整体荧光团显微镜ensemble-fluorophore STED microscopy在2000年才开发,而单一荧光体方法却在2006年才成功,2013年穆尔纳尔开发了新技术,超解析荧光显微镜开发了,并被广泛使用于细胞生物学、微生物学与神经生物学方面。

  3.5外科显微镜operating microscopy

    外科显微镜是用一个大功率的双目显微镜来执行专业外科手术,放大倍数为四倍至四十倍等,显微手术器皿需可灭菌或消毒,以防止交叉污染。第一位执行显微外科手术是瑞典籍耳鼻喉外科医师尼廉Carl-Olof Siggesson Nylén (1892–1978),被尊称显微外科之父,1921年在斯德哥尔摩大学执教时,首先用莱斯颠眼显微镜Brinell-Leitz microscope来执行动物模拟显微外科手术,同年11月使用来治疗一位患有中耳炎患者,执行外淋巴瘘管手术,很快单眼被取代了,1922年同事霍姆革连Gunnar Holmgren (1875 – 1954)开发了这种双目镜外科显微镜,起先被运用于耳科半规管显微手术,而显微血管神经外科手术的开发是在1953年后,一位土耳其裔雅歇吉尔医师Mahmut Gazi Yaşargil (1925 - ),追随瑞士名教授克拉原布哈Hugo Krayenbühl (1902 – 1985)学习血管神经外科,雅歇吉尔的构思引起杜纳吉Pete Donaghy的兴趣,便邀请雅歇吉尔到杜纳吉的伯灵顿微血管实验室研究,后来雅歇吉尔返回欧洲苏黎世继续有关显微手术的研究,后来出书立言其研究心得,书名「简易显微神经外科学」共四册。图三十六为兽医显微外科手术情形。

3.6暗视野显微镜dark-field microscopy

    暗视野显微镜不将透明光射入观察系统,物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见,照明光大部分被折回,由于样品所在位置结构及厚度不同,光的散射性与折光等均有很大的变化。也就是使用一种被仔细排列的光源,已尽量减少直接照射光的数量,并收集从样品背景散射光,成样品图像。暗视野显微镜照明系统较常见为雷因堡照明,他是依据英国显微镜学家雷因堡Julius Rheinberg,在1896年所发表的论文,这是利用阿贝的衍射理论,结合已知的暗背景,增强对比强度及分辨率等,立于活体标本与活组织之观察。

4电子显微镜

 电子显微镜简易的定义,就是使用一束电子作为光源的显微镜,亦拥有类似光学显微镜玻璃透镜的电子光学透镜系统(图三十七)。光束比自然光的波长更小,可以看更细微的结构,其影像解析能力可达50皮米。电子显微镜有两种类型,则透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)与扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)。

     1858年德国物理学数学家普吕克Julius Plücker (1801 - 1868),观察了阴极射线(电子)的边转与磁场的用途,此一效应在1897年被德国另一位物理学家布劳恩Karl Ferdinand Braun (1850 - 1918)(1909年诺贝尔物理学奖得主)所用,发明了阴极射线管示波器改善无线电波通讯领域,但电子被认为是带电粒子,电子的波性质完全未被开发,直到1923年法国物理学家德布罗律Louis Victor de Broglie (1892 - 1987),发表了德布罗律假说,电子波的性质才被知晓。世界上第一个电磁透镜在1926年被开发了,德国物理学家布什Hans Busch (1884 – 1973),是德国电子光学权威,在1928年匈牙利物理学家盖博Dennis Gabor (1900 – 1979) (1971年诺贝尔物理奖得主)与西拉德Leó Szilárd (1898 - 1964),试图说服布什打造电子显微镜,为此申请专利。德国物理学家卢斯卡Ernst August Friedrich Ruska (1906 – 1988,图三十八),与电子工程师克诺尔Max Knoll (1897 - 1969),研读布什理论与西拉德的粒子理论,在1931年发明第一台原型电子显微镜,两年后就是1933年,卢卡斯建造超分辨率的电子显微镜,1931年五月德国西门子公司科学主任电子工程师总监卢登堡Reinhold Rudenberg (1883 - 1961),获得电子显微镜专利,卢卡斯在1931年就证明了磁线圈可以充当电子透镜, 并在1933年使用了一系列的线圈来建造第一个电子显微镜,商业化电子显微镜是在1939年。

  电子显微镜用于调查微生物、细胞、大分子、合体标本、金属和晶体等超威结构解析,影像上使用专门数字摄影机和图像采集卡捕获图像(图三十九)。

4.1透射电子显微镜Transmission electron microscopy TEM or CTEM conventional TEM

    为一种显微镜技术,将一束电子通过标本在相互作用下,将图像传递放大并聚焦于图像设备上,荧光幕感光胶片层或电荷耦合装置等传感器。透射电子显微镜可运用于癌症、病毒学与材料科学以及污染、奈米技术和半导体研究等。

     就在卢卡斯研究团队如火如荼展开研究同时,北美洲美国华盛顿大学的安德森Paul Anderson与菲茨西蒙斯Kenneth Fitzsimmons,于1935年推出透射电子显微镜设计图,加拿大多伦多大学的希利尔James Hillier (1915 - 2007) ,与同事普利布斯Albert Prebus在1938年建造了北美洲第一台高解析透射电子显微镜(图四十)。二次世界大战期间,北美与欧洲均停止相关研究,不少科学菁英也因而战亡,大战结束后卢卡斯到西门子服务,继续他的电子显微镜研究,而全球性的科学竞赛也正式展开,英国的曼彻斯特、美国的RCA、德国的西门子、日本的日本电子株式会社等,1949年首届国际电子显微镜是在荷兰代尔夫特举行。经不断研发后,美国芝加哥大学的物理学教授克里夫Albert Victor Crewe (1927 – 2009),在1970年发明了电子枪,同时添加高质量物镜,因而产生了高水平的扫描透射电子显微镜。

4.1.1低温电子显微镜Cryo-electron microscopy cryo- EM

     低温电子显微镜是透射电子显微镜的样品在液态氮下,进行研究溶液内生物分子的结构高分辨率技术,运用于结构生物学方面居多。低温电子显微镜的设计需求,是因此一技术其样品,是不需要以任何方式器固定或染色,这与放射线电子显微镜不同,他须结晶样品,在此一过程中也许有少数样品,偶尔会产生非功能上的构象变化。再者放射线显微镜的执行需要大量辐射量,如此会有损害样品脆弱的化学结构疑虑。

     80年代早期许多研究固态物理团队,试图用不同的方法生产玻璃冰,在1984年瑞士物理学家杜伯歇Jacques Dubochet (1942 -,图四十一右上),其领导欧洲分子生物学实验室研究小组论文中,展示了水中嵌入腺病毒图像,该论文被认定是低温电子显微镜的起源。苏格兰生物分子学家亨德森 Richard Henderson (1945 -,图四十二)在剑桥分子生物学实验室求学博士学位时,是研究蛋白酶结构与机制,也因此他到美国耶鲁大学当任博士后客座研究员时,依然对膜蛋白情有独钟,1975年回分子生物学实验室时,与同事新西兰籍神经科学家安温Peter Nigel tripp Unwin研究膜蛋白及细菌视紫红质的电子显微镜构造,同年在自然杂志上的论文引起广大回响,显示细菌视紫红质含有七跨膜α-螺旋构造,之后亨德森继续这方面的研究,1990年再度在分子生物学杂志中,发表细菌视紫红质使用电子晶体学所扫描出来的模型,此技术一直被广泛使用,之后他专注于单粒子电子显微镜single particle electron microscopy的研究,这是生物物理学研究的利器,1995年的论文获得原子无晶体的结构,单粒子电子显微镜使用在很多方面,做了开创性的贡献,近期也使用单粒子低温电子显微镜。德国生物物理学家法兰克Joachim Frank (1940 -,图四十一左下),是单粒子低温电子显微镜发明人,对细菌和真核细胞的核醣体结构和功能亦有突出的发现。在普朗克研究所Max Plank Institut für Biochemie,研究数字图像处理和光学衍射在电子显微分析中的应用,以及利用相关函数对影像进行对比,博士毕业后也曾到加州柏克莱大学深造两年,1972返回普朗克研究所担任粒子电子显微镜研究助理,1975年被纽约州卫生部任命为高级研究员,来年担任纽约州立大学奥尔巴尼分校生物医学科学系教授,1987为欧洲度假时,会见了亨德森等生物分子学家。2017年诺贝尔委员会颁发诺贝尔化学奖给杜伯歇、亨德森与法兰克三人,奖励他们在低温电子显微镜上的卓越贡献。

4.2扫描隧道显微镜Scanning tunneling microscopy STM

     扫描隧道显微镜是扫描电子显微镜(图四十三)的一种,以量子隧穿效应来探测物质表面结构,基于对探针和表面之间隧穿电流大小的探测,可在低温下利用探针尖端观察表面上单原子级别的起伏。扫描隧道显微镜是德国物理学家罗瑞尔Heinrich Rohrer (1933 - 2013)与物理学家宾尼格Gerd Binnig (1947 - ),1981年两人在瑞士苏黎世IBM研究室发明的。两人与电子显微镜发明人卢斯卡共得1986年诺贝尔物理学奖。宾尼格在1987年来到IBM莫尼黑物理研究室,研发一种称之为原子力显微镜Atomic force microscopy AFM,是另一扫描探针显微镜,金属探针沿样品表面移动,电子在探针由原子的电子样品上排斥,机制纪录探针的活动数据,导入数据库系统,生成样品表面三D图像。这些均是依据量子物理学理论。英国发行的医学成就中的那枚扫描电子显微镜镜检图,倒是较像是扫描隧道电子显微镜镜检图(图四十四)。

5其他显微镜

     衍射极限问题之后的解决之道,就是寻寻觅觅可见光之外的光源,包刮紫外线等。德国物理学家伦琴Wilhelm Conrad Röntgen (1845 - 1923),在1895年发现了X射线时,当下社会大众不清楚X射线,物理学家们也不清楚这新射线是何性质?实验现象说明X射线是电滋波,但同时有粒子的特性因载子是光子,1912年德国物理学家劳厄 Max Theodor Felix von Laue (1879 - 1960)证明X射线是一种电滋波,1914年因发现晶体中X射线的衍射现象,获得诺贝尔物理学奖(图45)。

5.1 X射线衍射晶体学显微镜X-ray diffraction crystallographic electron microscopy

    丹麦解剖学地理学家史坦诺Nicolas Steno (1638 – 1686),在1669年就谈到晶体具对称性,而法国晶体学家阿羽依René Just Haüy(1743 – 1822)在1784年发现晶体可以简单描述堆栈模式相同的形状与大小,因此英国晶体学家米勒William Hallowes Miller(1801 - 1880)在1839年制定一个成为米勒指数(或称晶面指数)的方法,来规范每一个化学式的方位号码,布拉菲晶格是法国物理学家布拉菲Auguste Bravais (1811 - 1863),在1845年将3D晶体原子排列的14种立体结构法则,完整的晶体结构陆续被发表,包括德国医师希歇尔Johann Friedrich Christian Hessel (1796 - 1872)、苏俄数学家晶体学家菲多洛夫Evgraf Stepanovich Fedorov (1853 - 1919)、德国数学家施柯安菲利斯Arthur Moritz Schönflies (1853 - 1928),而英国地质学家巴洛William Barlow (1845 - 1934),在1894年发行论述里面共有230多种晶体化合物3D结构,虽宣称部分来自菲多洛夫与施柯安菲利斯等,但当时并未被采信,日后晶体学日愈发达并部分被证实。美国遗传学家缪勒Hermann Joseph Muller (1890 - 1967),在1923年就以镭与X射线来照射雌性果蝇,观察其染色体变化情形,由于曾在摩根实验室任职过,对于晶体结构也有独到的见解,X射线与显微镜结合观察,在其论文中屡见不鲜(图四十六),因X射线与突变的研究卓著独获1946年诺贝尔生理医学奖。

    英国化学家克卢格Aaron Klug (1926 -,图47),在他求学时代人们对于病毒学,一直非常感兴趣,但有关结构等问题也都悬而未决,烟草镶嵌病毒是具代表性的菌种,其结构问题也同出一辙,1962年克卢格使用X射线衍射与显微镜结构模拟方法,发展晶体电子显微镜,从不同角度拍摄2D影像序列到生成目标3D影像。也因用X射线衍射晶体学显微镜技术,在病毒学以及其他由核酸与蛋白质构成的粒子,等结构分析作出卓越贡献,获1982年诺贝尔化学奖(图48)。

6后言

 2005年科赫获得诺贝尔生理医学奖百周年时,德国发行一枚纪念邮票(图49),那台显微镜由载玻片与物镜的距离可看出,那是油浸透镜,在显微镜旁边有不少配件,可能是客制式显微镜,相较其日籍学生北里紫三郎的显微镜,是有非常大的落差。从显微镜的一系列方寸中,看到早期发明者的科学史与个人际遇,伽利略在观察大宇宙与小宇宙时,由于抵触教廷教意而被列为异教徒,这一串串的故事有忧有喜,感触真是彭湃飞舞,就像葡萄牙2014年发行的国际晶体学年纪念票一样(图五十),左边是红血球右边是血红素分子结构,象征人类从红血球的发现,到血红素分子的发现,观察工具由放大镜式透镜,到超越衍射极限的电子显微镜,科学的发展真是神速无比。

7参考数据

1 From dilettante to diligent experimenter : A reappraisal of Leeuwenhoek as microscopist and investigator / Brian J. Ford / Microbiology

2 Super-resolved fluorescence microscopy/ Måns Ehrenberg / nobelprize.org

3.2014, 2017诺贝尔化学得主/ nobelprize.org

4Microscope, Microsurgery/维基百科

5显微镜/奇妙的发明/李勉民编译/读者文摘远东有限公司

6光的本质,科学仪器-显微镜与望远镜/牛顿现代科技大百科/陈琳琳编译/牛顿出版股份有限公司/原著: The Great Scientists / The world of Science Encyclopedia /A. Jack Meadows /Equinox Print co,. Ltd. UK


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