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科塞尔:荣获1910年诺贝尔生理学或医学奖

 

 

核酸的发现
    1868年,在德国化学家霍佩—赛勒(HoppeSeyler)的实验室里,有一个瑞士籍的研究生,名叫米舍尔(F.Miescher, 1844—1895),他在实验室所承担的工作是研究脓血中细胞的化学成分。当时实验室附近有一家医院,常常扔出许多带脓血的绷带,脓血里有与病菌“作战”而死亡的白细胞以及其他死亡的人体细胞。米舍尔细心地用洗脱的办法将绷带上的脓血收集起来。他先用酒精把细胞中的脂肪性物质去掉,然后用猪胃黏膜的酸性提取液(一种能除掉蛋白质的胃蛋白酶粗制品)进行处理,结果发现细胞的大部分被分解了,而细胞核只是缩小了一点儿,仍然保持完整。得到细胞核后,米舍尔对组成细胞核的物质进行了化学分析,发现细胞核内含有与细胞内其他有机物明显不同的物质,这种物质的磷含量很高,远高于蛋白质,而且对蛋白酶有耐受性。米舍尔认为这是一种新物质。霍佩—赛勒当时是生物化学界的权威,治学严谨,他要在亲自做实验验证米舍尔的工作后,才允许米舍尔发表这个成果。霍佩—赛勒用酵母细胞做实验,

证实了米舍尔的发现。米舍尔将他发现的新物质命名为“核素”。核素十分不稳定,提取时必须非常小心,速度要快,还得保持很低的温度。为了制备核素,米舍尔常常从清晨5∶00就开始在低温的房间里工作,这大大影响了他的健康。由于积劳成疾,他51岁就离开了人间。
    霍佩—赛勒的另一个学生,德国的科塞尔(A.Kossel, 1853—1927),发现核素是蛋白质和核酸的复合物。他小心地水解核酸,得到了组成核酸的基本成分:鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶,还有些具有糖类性质的物质和磷酸。确定了核酸这个生物大分子的组成之后,随之而来的问题是这些物质在大分子中的比例,它们之间是如何连接的。斯托伊德尔(H.Steudel)找到了前一个问题的答案。通过分析,他发现单糖、每种嘌呤或嘧啶碱基、磷酸的比例为1∶1∶1。限于当时的实验条件,后一个问题没有完全解决,科塞尔及其同事只是发现,如果小心地水解核酸,糖集团与含氮的基团是连在一起的。科塞尔还对核酸与蛋白质的结合方式进行了研究。他发现有些物种的核酸与蛋白质结合比较紧密,有些则比较松散。科塞尔因其在核酸化学领域的开创性工作,荣获1910年的诺贝尔生理学或医学奖。
    1911年,科塞尔的学生列文(P.A.T.Levine,1869—1940)对核酸做了进一步的研究。他证明核酸所含的糖类由5个碳原子组成,并将这种糖类命名为核糖。当时已经发现两种不同的核酸,列文找到了它们之间的区别:它们中的五碳糖不同。另一种糖类比核糖少一个氧原子,称为脱氧核糖。两种核酸也由原来的名字改为核糖核酸和脱氧核糖核酸。1934年,列文发现核酸可被分解成含有一个嘌呤、一个核糖或脱氧核糖和一个磷酸的片段,这样的组合叫核苷酸。他认为核酸是由五碳糖与磷酸基团组成的长链,每一个五碳糖上再接一个碱基。列文认为这些碱基可能以一种非常简单的方法排列,如12341234等,每个数字代表一种特定的碱基。这个模型后来被称为核酸结构的四核苷酸假说。列文虽然没有获得诺贝尔奖,但他的贡献有目共睹,并将永远留在核酸化学的历史中。
    弄清物质结构的最终证明是成功地合成出这种物质。核酸的结构问题很复杂,糖类和碱基都是结构比较复杂的组分,有多种连接的可能,而且还有磷酸基团的位置问题。英国生物化学家托德(A.R.Todd)成功地合成了核苷酸,并于1955年成功合成了二核苷酸。托德因其在核苷酸合成以及核苷酸辅酶方面的贡献而获得1957年诺贝尔化学奖。
    核酸功能的阐明以及DNA双螺旋结构的揭示的科学发现史已为大家所熟知,《遗传与进化》模块将做详细的介绍,这里不再赘述。
    2.核酸的分离和提纯
    研究核酸首先要对其进行分离和提纯。制备核酸要注意防止核酸的降解和变性,尽量保持其在生物体内的天然状态。早期研究时,由于受到方法上的限制,得到的样品往往是一些降解产物。要制备天然状态的核酸,必须在温和的条件下进行,防止过酸、过碱,避免剧烈搅拌,尤其是防止核酸酶的作用。
    真核生物中的染色体DNA与组蛋白结合成核蛋白(DNP),存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(如质量浓度为1 mol/L的NaCl溶液),但不溶于质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液。利用这一性质,可将细胞破碎后用浓盐溶液提取,然后用水稀释至0.14 mol/L,使DNP纤维沉淀出来,缠绕在玻璃棒上,再经多次溶解和沉淀以达到纯化目的。苯酚是很强的蛋白质变性剂,可用苯酚抽提,除去蛋白质。用水饱和的苯酚与DNP一起振荡,冷冻离心,DNA溶于上层水相,不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面,一部分变性蛋白质停留在酚相。如此操作反复多次以除净蛋白质。将含DNA的水相合并,在有盐存在的条件下加2倍体积冷的乙醇,可将DNA沉淀出来。再用乙醚和乙醇洗涤沉淀,用这种方法可以得到纯的DNA。
    RNA比DNA更不稳定,而且RNase又无处不在,因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3点:(1)所有用于制备RNA的器具必须灭菌;(2)在破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase失活;(3)在RNA的反应体系中加入RNase的抑制剂。目前最常用的制备RNA的方法有两种:(1)用酸性盐/苯酚/氯仿抽提。是极强烈的蛋白质变性剂,它几乎使所有遇到的蛋白质都变性。用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。(2)用盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质在最上层,DNA位于中间,RNA沉在底部。此法可制备较大量高纯度的天然RNA。不同功能RNA常分布于细胞的不同部位,分离这些RNA常常先用差速离心法,将细胞核、线粒体、叶绿体、细胞质等各部分分开,再从这些部分中分离出RNA。
    3.核酸的水解
    核酸的嘌呤碱和嘧啶碱与戊糖形成糖苷键。戊糖有两种:核糖和脱氧核糖,所以形成4种糖苷,即嘌呤核苷、嘌呤脱氧核苷、嘧啶核苷、嘧啶脱氧核苷。磷酸基与两种糖类分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯。所有糖苷键和磷酸酯键都能被酸、碱和酶水解。
水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶;专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。核酸酶按底物专一性分类,又可分为作用于核糖核酸的核糖核酸酶,作用于脱氧核糖核酸的脱氧核糖核酸酶;按对底物作用的方式,可分为核酸内切酶和核酸外切酶。内切酶的作用点在多核苷酸链的内部,而外切酶的作用点从多核苷酸链的末端开始,逐个地将核苷酸切下,从而对核酸进行降解。也有少数酶既可内切,也能外切。
    4.核酸在不同生物(细胞)中的分布状况
    所有生物细胞都含有DNA和RNA这两类核酸。原核细胞DNA集中在拟核。真核细胞DNA分布在核内,与蛋白质组成染色体(染色质)。线粒体、叶绿体等细胞器也含有DNA。病毒或只含DNA,或只含RNA,从未发现两者兼有的病毒。原核生物DNA、质粒DNA、真核生物细胞器DNA都是环状双链DNA。所谓质粒是指拟核DNA外基因,它能够自主复制,并表现出特定的性状。真核生物染色体DNA是线型双链DNA。病毒DNA种类很多,结构各异。动物病毒DNA通常是环状双链或线型双链。植物病毒基因组大多是RNA,DNA较少见。少数植物病毒DNA或是环状双链,或是环状单链。噬菌体DNA多数是线型双链,也有为环状双链的。
    参与蛋白质合成的RNA有三类:转移RNA(tRNA),核糖体RNA(rRNA)和信使RNA(mRNA)。无论是原核生物或是真核生物都有这三类RNA。20世纪80年代以来,陆续发现许多新的具有特殊功能的RNA,几乎涉及细胞功能的各个方面。病毒RNA种类很多,结构也是多种多样的。
    5.核酸中核苷酸的连接方式
    核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子,无分支结构。核酸中的核苷酸以磷酸二酯键彼此相连。DNA中的脱氧核糖核苷酸,通过3′,5′-磷酸二酯键连接起来,形成直线形或环形多聚体(图9)。组成RNA的核苷酸也是以3′,5′磷酸二酯键彼此连接起来的。
    回顾起来便会发现,在分子生物学兴起之前所有的实验方法对充分了解基因来说都完全不适用。从1910年到1950年这一段时间里越发认识到遗传的物质基础是由高度复杂的分子所构成,要取得进一步进展唯一的办法是更多地了解基因的化学。将遗传的分子基础无论看成是无定形的颗粒还是当作简单分子显然都不合式。基因的研究已不再是传统的生物学家的问题;它已经成为生物学、化学、和物理学之间的边缘地带,而且起初是无人区。在1940年代,当基因问题被各方面的学者认真考虑和研究时,才知道在解决基因的结构方面化学已经走在前头,做了大量工作(Calms,stent,and Watson,1966)。
    到了1880年代中期,一般都认为细胞核是遗传的基地,或者范围更窄一些,染色体,或者更专门一些,染色质,才是真正的遗传物质。“染色质”这词是弗莱明(Flemming)于1879年创用,指细胞核中可以染色的物质而言。这立即引出了染色质的化学性质问题:它是不是一种特殊的和其它物质不同的物质,或者是一种与细胞质蛋白质不同的蛋白质?实际上这问题的答案早在十年前(1869)就由瑞士生理学家和有机化学家米歇尔(Friedrich Miescher,1844-1895)作出,他证明染色质根本不是蛋白质。
    米歇尔于1868年在医学院毕业后,遵照他舅舅,著名的解剖学家和组织学家西斯的意见从事组织化学研究。正如西斯所说,“因为在我自己的组织学研究中我曾经一再表示关于组织的发育的最终问题只能由化学来解决,米歇尔于是决定在著名有机化学家Hoppe-Seyle的实验室接受博士后训练,并在1868年复活节抵达德国南部小城吞宾根。”
    Hoppe-Seyle建议米歇尔研究“淋巴细胞的组成”,因为它们在医学上相当重要。米歇尔采用脓作材料,这在抗菌素发明以前在医院中是很充裕的。他是谨慎、勤奋而又有才干的青年人,建立了完全新的分离方法并且很快就能够将脓细胞和脓的其他组份分开。然后他就试图将脓细胞的细胞质与细胞核分开,分析和测定细胞质的成分。开始时一切努力都告失败。在他的某次提取程序中所得到的末产物是一种沉淀,不具备任何已知蛋白质的性质。后来他又用高度稀释的盐酸洗完整的脓细胞,最后得到的完全是细胞核。因此那未知物必然是来自细胞核。因为细胞质成分的研究走进了一条死胡同,所以米歇尔决定改而研究细胞核的化学。
    我之所以比较详细地介绍这些事态的发展顺序是因为后来虚构了一种神话说什么米歇尔开展他的研究是为了解决遗传现象的奥秘。完全不是这回事!实际情况不过是一位有机化学家根据他舅舅的意见想为细胞和组织的化学增添一些知识。当阅读米歇尔的文章时予人印像很深的是他在方法上的独创性。他总是采用新技术,特别是新的提取与纯化程序,由于他的勤奋和智巧,他之所以成为DNA的发现者是完全当之无愧的、我想这样说也是正确的,即在米歇尔之前,生物化学家采用的是完整组织,而米歇尔则是用分离的细胞;或者甚至是细胞的一部分,例如细胞核。当他分析从细胞核得到的物质时,他发现其突出特点是含有大量的磷。由于这细胞核物质不同于已知的有机物,米歇尔便将之称为“核素”(nuclein)。
    米歇尔于1868年春到吞宾根并在1869年秋末完成了他的发现报告。但是Honne-Seyler并没有立即发表这篇报告,因为这发现一结果十分出人意外,他决定亲自加以审核。当他以及他的一些其他学生的实验结果与米歇尔在报告中所陈述的完全相吻合时,这篇关于核素的手稿才于1871年春发表。
    米歇尔于1871年返回瑞士巴塞尔后,他发现莱因河的鲑鱼是核素的丰富来源,因为鲑鱼的每个精子就是一个细胞,精子的头部基本上就是细胞核。米歇尔现在几乎拥有无尽无休的核素宝藏(他曾开玩笑地说过,鲑鱼的睾九提供了成吨的核素)并在第二年专心致志地研究它。他发现核素和一种蛋白质紧密联系在一起,他将这蛋白质命名为“鱼精蛋白”(Protamine)。他还测定了核素的许多化学性质和物理性质,包括它的实验式。
    十分遗憾的是,在他首次取得卓越成就之后,米歇尔随后的研究事业走的是下坡路。由于他是一位出类拔萃的人物所以就更加令人惋惜。也许这是由于他是五兄弟中的长兄,具有长子的一切特点的缘故。他提出的问题往往是循规蹈矩的而不是开拓性的(Sulloway)。虽然很快就了解到核素就是细胞学家所说的染色质,但是米歇尔从来不把它看作是遗传信息的载体。他不去提问遗传学问题而只是提出生理学的或纯粹化学上的问题,例如“生物在精子形成时是从什么地友得到这样多的磷合成大量的核素?”1872年他公开谈起他要研究“核素的生丨学问题,它的分布、化学结合、它在身体内的出现与消失,它的更新。”
    在Carl Ludwig,Julius Sachs,以及西斯的影响下,米歇尔采取当时很时髦的物理主义者的和非常机械的态度看待生物学现象。这可以用他按接触学说的观点解释受精过程作为例子很好地加以说明。“假定卵细胞的性质,和一般细胞比较来说,是由控制其完整结构的一系列因素中某个缺少的一环这种情况决定的,因为在卵细胞中含有其它的一切必需细胞成分。但是当卵成熟时(细胞核中的)鱼精蛋白分解生成氮(N)……这个在其它方面完全完好的机器由于缺少一个螺丝就无法运行。精子将这螺丝在恰当的位置再度插入后,就恢复了原来完整的结构。它不再需要任何其它的东西。在某处的化学物理静止性被触动或受到干扰时,机器便又开始运转,每个卵细胞产生鱼精蛋白供应邻近细胞,因而运动就按一定的规律扩展开。”这里一个字也没有提到两个亲本配子遗传物质的结合。米歇尔是如何高度评价纯粹机械方面的问题也可以由他所提的问题看出:“不同物种的精子是按什么方向和深度穿入卵中原生质的?”
    米歇尔似乎认为核素的研究比较不怎样重要便转向除教学工作以外的其他研究。从1874年到1887年左右这14年时间里他研究过鲑鱼的生活史与代谢,精子尾部的化学,精子头部详细形态的结构,蛋黄的化学,瑞士联邦政府机构的营养问题,人体血液化学的变化与海拔的关系等。给人的印象是他的研究目的是由机会决定而不是考虑科学上的重要性。只是到了晚年他才又回到DNA研究并且在魏斯曼学说的影响下开始提出“正确的”问题。但是时间已经太晚了,因为不幸的是他很快就因肺结核而去世,享年只有50岁。
现在已经知道DNA是遗传程序的化学基础,自从沃森(Watson)和克里克(Crick)在1953年发现DNA的分子结构以后,科学史家非常注意DNA研究的历史。已经出版了五、六本有关书籍以及某些生物化学通史中的长篇章节。我在这里只介绍一些重点并侧重DNA研究与生物学有关的方面。
    米歇尔研究的是分离了的细胞核,即与细胞质分离后的细胞核。这使得他能够用各种不同的化学试剂来检试它们与核素的反应。将由此所得到的知识运用于完整细胞自然合乎逻辑。细胞学家Zacharias(1881)首先运用这方法在显微镜下观察细胞对各种试剂的反应。他发现细胞核与染色体对胃蛋白酶及稀盐酸具有抗性,溶于碱,在盐溶液中膨胀。所有这些都是米歇尔的核素的特点。其它的细胞成份,例如纺锤丝,并不显示核素反应,弗莱明(1882)由此得出结论,“染色质报可能和核素完全相同,如果不是这样,则从Zacharias的工作看来它们就是一个携带着另一个。染色质这词在它的化学实质弄清楚以前是可以使用的,同时它又表示细胞核中容易染色的物质。”
    后来Hertwig,Strasburger,Kolliker,以及Sachs也都同意把染色质看成与核素完全相同,至少他们实际上在文章中就是如此看待。这不仅是德国细胞学者的个人意见,因为俄国进化主义者Menzbir于1891年就曾说过。“因此,毫无疑问只有染色质和双亲的特征传递给子女(推而广之,物种的性状从一代传给下一代)有关。”Zacharias的论点也被化学家接受,例如德国化学家科塞尔(Kossel)在1893年曾说:“组织学家所说的染色质基本上就是多少含有一些清蛋白的核酸化合物,在某种程度上可能就是纯核酸。”
可是后来有人声称早期学者所说的核素是极其不纯的核蛋白,是DNA和大量蛋白质的混合物,因而和这些早期学者是否应享有发现DNA是遗传物质这一荣誉的问题无关。米歇尔和科塞尔的核素确实不是绝对纯净的DNA,但也决不像后来有人所说的那样混杂有大量蛋白质。这可以从米歇尔和科塞尔提出的实验式清楚看出:
  米歇尔          C29H49N9O22P3
  科塞尔          C29H36N9O26P3
  DNA  (50%AT:50%GC) C29H35N11O18P3
              (现在认为是正确的)
米歇尔的样品可能含有一定程度的水(水合作用),但是无论是米歇尔的还是科塞尔的实验式都看不出含有蛋白质。如果含有蛋白质,C及N的值相对于P3来说应当更高(这是W.MeClure告诉我的)。
    在上一个世纪末威尔逊(E.B.Wilson)在他的名著《细胞学》的第二版(1900)中指出,“染色质可能就是核素。……细胞核物质,尤其是染色质,是遗传现象中的首要物质,这一点已得到成熟作用,受精作用和细胞分裂的研究结果大力支持”。然而他又有些怀疑“染色质究竟能不能真正被看作是像Hertwig和Strasberger所说的那样是异胞质(idioplasm)或遗传的物质基础”。
    核素发现后不久就有人提出(Sachs,1882)不同的物种的核素在化学上也应当有所不同。早在1871年Hoppe—Sevler就曾指出酵母含有核素,1881年证明高等植物也有核素。1880年代正是系统发生的研究处于高潮的时候,对低等无脊椎动物的核素研究是企图将会发现某种“原始核素”比鲑鱼核素更简单得多以证明系统发生。当发现海胆的核素和鲑鱼的基本相同时这一愿望便告落空。19.1 种质的实质
    一旦认识到染色质(大部分)由DNA组成以及染色质就是种质(germ plasm)之后不久,染色体的基本性质究竟是形态上的还是化学方面的这个问题就引起了争论。生物学家几乎一致地反对纯化学的解释,说什么核素在化学上是过于简单的物质不足以说明种质结构的极端复杂性。波弗利(Boveri,1904)用比喻来说明他的观点。如果将细胞核比作表,“细胞核的形态涉及表的全部机件,而细胞核的化学至多只能告诉我们这表的齿轮是用什么金属制成的”。这就又是瞎子摸象的情况,因为这问题的最终解决是依靠高分子的形态(波弗利的那个时候是不了解的)来说明种质的不寻常结构。
在早期的学者中,德弗里由于同时具有植物学和物理化学的坚实基础,所以他的观点是最正确的。他强调指出种质决不可能是简单的化学物质:“在历史过程中所获得的性状要求有一个如此复杂的分子结构,而当今的化学是完全无法作出解释的”,甚至在他以前Kolliker(1885)也曾说过“具有完全相同化学组成的细胞核由于其有效物质(异胞质)的分子结构可能具有不同的效应。”这真是预见性的见解!
    到了1880年代末期细胞学者运用他们的方法作出了他们所可能作出的贡献。他们尽可能具有说服力地揭示了染色质符合遗传物质的一切要求以及精子的头部实际上是真正的遗传物质。至于这些物质在化学上究竟是什么他们并不特别关心,他们也不注意这些分子的大小和结构。这种情况很特别,因为本来就应该很清楚除非知道了DNA的结构否则它在遗传中的作用就永远也无法说明。我在查阅文献中发现这个问题从来也没有认真地被提出过,可能就是由于当时还没有提供回答这问题所必需的数据资料的实验方法。
    到了这个时候问题就由化学家接了过来,在半个多世纪里探索DNA的本质就完全是化学的事。头一个要求就是证实核素确实是一种与蛋白质完全不同的物质并且和生物有机体中的其它含磷丰富的物质(如卵磷脂)无关。米歇尔对这些问题还认识不清。为了证实核素的独有特征便必须建立纯化(提纯)核素的方法并保证蛋白质被除掉。Altmann(1889)胜利完成了这一任务并且将这不含蛋白质的细胞核物质定名为核酸。核酸和蛋白质根本不同化学家要比生物学家了解得更清楚。一直迟至1900年,威尔逊还以为纯核酸通过一系列含磷越来越少的步骤转变成清蛋白;“它们因不同的生理情况而改变其组成”。
    就纯DNA的研究来说,研究者在理论上有两条路可走。他们或者是将DNA分子加以分解而研究其组分;或者是研究DNA整个分子,在192o年代Staudinger创立了聚合物化学理论之后就是按这种方式进行研究。但是,后一条途径在有机化学的概念结构之内是走不通的,因为有规化学的概念结构在十九、二十世纪交替时是由胶态化学的观念支配。
    在随后的五十年中核酸研究的两位著名带头人是柯塞尔和列文。生物化学史家对核酸分子化学本质是怎样逐步阐明的已有介绍(Fruton,1972;Portugal and Cohen,1977)。到了1910年普遍认为DNA分子含有四种碱:两个嘌呤(鸟嘌呤和腺嘌呤)和两个嘧啶(胞嘧啶和胸嘧啶),一个磷酸盐,一个糖。但是又经过了40年才最后确定这些组分是怎样联结的(1953)。
    柯塞尔(1853-1927)在Hoppe-Seyler的实验室中于1879年开始研究核素,并在当年于核素的分解产物中发现了一种碱、次黄嘌呤。后来他证明这次黄嘌呤是来自另一种碱(腺嘌呤)并陆续发现和确认其它三种碱。
    1908年列文(1869-1940)开始研究DNA并在不久之后就成为这一方面的领导人。早在1893年柯塞尔就曾指出有一种戊糖是酵母核酸的成分之一,1909年列文及Jacobs检定这戊糖是核糖。其他研究者从小牛胸腺制各核酸(“胸腺核酸”)并在其中发现了一种特殊的糖。它非常不容易检定,但是列文及其同事终于(1929)证明它是2一脱氧核糖。多年来都认为核糖是植物核酸的精,脱氧核糖是动物核酸的精。然而后来在胰脏和其他动物细胞中发现了核糖核酸(RNA)。在植物细胞的细胞核中发现了脱氧核糖核酸(DNA)。但是一直到1930年代左右才充分了解一切动物和植物细胞同时含有DNA及RNA。细胞化学家对核酸在细胞中的功能认识非常模糊,最经常提到的是作为pH缓冲剂或协助能量转移。
    在本世纪的头30年中虽然对DNA的化学组成了解得不少,但是对DNA分子作为一个整体的了解及其生物学功能的认识却进展很小。在这段时期中自始至终都错误地假定这四种碱在核酸中以等量存在并成为所谓的DNA分子结构的四核苷酸学说的根据。这学说将核酸看作是相当小的分子,分子量约为1500。应当注意的是为了取得DNA的组分,柯塞尔和列文都采用了有机化学中十分剧烈的分析方法。我们现在知道这些方法破坏了实际上是非常巨大的分子。然而在当时按不同方法所得到的小分子量很符合那时流行的胶体化学概念。一直要等到1920和1930年代聚合物化学兴起以后才取得新的进展。

遗传现象的核酸学说
    当DNA是一个相当小的简单分子的这种看法流传开来时,认为DNA具有控制发育能力的观点就逐渐全去了说服力。考虑到发育过程和途径的极端复杂性,这样一个简单的小分子怎样可能在遗传现象中以及从受精卵到完全成长的生物有机体的发育过程的控制上具有重要作用?对比来说,含有20种不同氨基酸的蛋白质大分子倒似乎能够提供无限数量的排列与组合。
    不仅仅化学上的理由使大多数生物学家在1900年以后放弃了DNA是遗传物质的观点,而且在有丝分裂过程中染色体物质只是在染色质浓缩成染色体时才浓重着色这一现象也使他们迷惑不解。在细胞静止期中染色体似乎分解成不易染色的展开了的颗粒状物质(当时还没有DNA专一性染料)。波弗利早在1888年就曾提到在静止期染色质从染色体框架中消失而在有丝分裂开始时又重新形成。他的这种看法后来被越来越多的人引用,到了1909年Strasburger认为染色质“可能是遗传单位载体的营养物……染色质本身不可能是遗传物质,因为它随后就脱离染色体而且在细胞核中其含量也因发育阶段不同而变化”(Strasburger,1909:108)。Goldschmidt于1920年特别着重指出,“如果按习惯认为染色体中的核素是遗传物质,那么就决不可能有某种化学概念能解释它的多种多样效应。”贝特森(Bateson,1916)也以同样口吻声称:“认为染色质颗粒(彼此无从分辨,实际上用任何检验方法检查其结构都相同)能够根据它们的物质性赋予生物以生命的一切特征的这种假定完全超越了甚至是最有说服力的唯物主义范围。”
    即使在1924年发现了高度专一性的灵敏福尔根染色(Feulgen stain),在一些制备物(例如海胆的卵母细胞)中也发现其中的细胞核似乎不含染色质。到了1925年甚至威尔逊也放弃了核素是遗传物质的观点:“到目前为止正如染色反应所指陈,持续存在的并不是嗜碱性成分(核酸)而是所谓的非染色质物质或嗜酸物质。在细胞活动的不同阶段核酸成分时有时无。”
    以为核酸并不是遗传物质的原因除了一般的有机化学方法的破坏性以及还缺少在有丝分裂的各个阶段测定DNA含量的适当方法以外,还有关于化学上相互作用的一些陈腐观念。植物学家Strasburger(1910)就强烈反对将“真正的受精作用看作是单纯的化学过程,因而反对任何一种遗传的化学学说……就我看来,受精的真谛在于具有有机体结构的因素互相结合。”他在1910年说这番话还是情有可原的,因为那时化学过程的幼稚胡涂观念仍占支配地位,而复杂的、三维高分子概念还没有诞生。
    聚合的高分子新概念有很强的吸引力,因为它似乎满足了很多机械论生物学家的一切生物性物质“最终都由晶体构成”的古老设想。德国化学家Standinger的聚合物新学说一旦出现Koltsov(1928;1939)就据以推测染色体物质的晶体性质。16年后著名物理学家Schrodinser(1944)提出了他的非周期性振动晶体学说,公开宣称他是受了一篇文章的影响,这文章的领先作者是Timofeeff—Ressovsky,曾经是Koltsov的助手。
    由于聚合的高分子很容易降解成其组成部分,它们的提取要求采用比科塞尔和列文使用的更精细温和的方法。当采用这类方法、尤其是Hammarsten的瑞典学派的方法时,所得到的产物是“雪白的,具有像火棉一样的特殊稠度”,和按剧烈提取方法所得到的降解产物完全不同。
    研究这样大的分子需要完全新的方法。当1930年代和1940年代Caspersson及其它人采用了这些方法(超速离心,过滤,光吸收等等)后,出乎每个人意外的是DNA分子的分子量是50万到100万,比以前测得的(1500)大两个数量级。实际上它们比蛋白质分子还要大。这些新发现完全排除了DNA作为遗传信息载体学说的一个重要反对意见。下一步要求,也是更困难的要求,是寻我一种方法将DNA和蛋白质干净彻底地加以分离并用生物学方法论证DNA组分和遗传性传递直接有关。这一任务于1944年实现。
    艾弗里及其同事在研究肺炎球菌的转化因子时提供了这种证据。人们早就知道肺炎球菌有几种类型,它们的毒力不同。英国细菌学家F.Griffith(1877-1941)于1928年发现当他对老鼠同时注射活的R(粗糙)型无毒肺炎球菌以及加热杀死的S(光滑)型有毒肺炎球菌时,很多老鼠不久即死亡,它们的血液中含有活的S型细菌。这一发现表明活的无毒R型细菌从死去的有毒S型菌得到了一些什么东西从而使无毒的R型转化成有毒的S型肺炎球菌。后来认为某些遗传信息被“转化因子”转移了。经过多年实验,艾弗里,Macleod与McCarthy(1944)成功地证明在无细胞的水溶液中的转化因子就是DNA。通过一系列非常灵敏的检验(免疫反应等等)证明它的确是纯DNA而不是像某些艾弗里的反对者所声称的与DNS相眹的有关蛋白质。这DNA溶液对检验蛋白质的任何方法丝毫也不显示反应。此外,艾弗里及其同事还证明实验中并不牵涉化学诱变剂因为这特有的遗传性变化是可以预先知道的。核物质的独立自主性还由它在转化了的细胞中自我增殖(自我复制)以及后来的连锁(linkage)试验进一步证实。最后,当用高度特异性的酶、脱氧核糖核酸酶,处理时,转化因子即完全而又不可逆地失去活性。它的分子量约为50,紫外线吸收显示核酸特有的特征。
    艾弗里及其研究小组在解释他们的发现时仍然非常谨慎(也许是过于谨慎!)然而证据是如此充分他们用不着再去证明他们的论点;这时情况已完全相反,该轮到反对派来反驳艾弗里的论述了。
    艾弗里这些发现的冲击就像电击一般。我可以根据我自己的亲身经历来证明这一点。在1940年代后半期的一个夏天我在冷泉港度假。我的朋友和我都深信这已经最后论证了DNA是遗传物质。著名免疫学家Burnet在1943年访问了艾弗里的实验室后曾写信给他的妻子:“艾弗里刚刚完成了一桩非常激动人心的发现,十分直率地说,这决不亚于以脱氧核糖核酸的形式分离了一个纯基因”(olby,1974:205)。单在1946年它就是六个重要学术会议的论题。当然,也并不是每个人都改变了态度,穆勒(Muller,1947)就表示极大怀疑,Goldschmidt则迟至1955年还仍然抱有怀疑态度,他在他的名著《理论遗传学》(1955)中写道:“我们的结论是……这不能说成是定论或者认为DNA是遗传物质已经是证实了的事实。”Goldschmidt在写这书时已是76岁高龄。然而阻力也不限于来自年老的遗传学家。某些生物化学家,例如A.E.Mirsky,甚至抱有更深的怀疑态度。
    怀疑派所提出的问题是转化因子究竟是纯DNA还是和DNA混杂在一起的少量蛋白质,这种混杂的可能性是由Mirsky和某些其它怀疑论者提出的。值得注意的是这些人大都是“噬菌体集团”(Phage group)的成员,包括德尔布吕克和Luria,他们对生物化学都知之不多。虽然他们也都充分了解艾弗里的发现,但仍然沉湎于四核苷酸学说,因而不能相信DNA能够具有遗传物质所必需的复杂性。他们的怀疑态度具有相当大的影响因为噬菌体集团在当时的分子生物学领域中占有支配地位。当他们这个集团自己的两位成员Hershey和Chase用放射性标记的细菌病毒(即噬菌体)进行实验并取得肯定结论之后他们最后才改变态度。Hershey-Chase实验的细节可参考遗传学教科书。虽然这实验的分析论证的精确性实际上不及艾弗里的分析,但噬菌体集团却将之看作是最后的决定性证据(Wyatt,1974)。
艾弗里的实验结果发表后,正如恰伽夫后来所说的,引起了一场真正“雪崩”式的核酸研究热潮。恰伽夫本人就谈到他扔下了手头的一切工作改而从事核酸研究(Chargaff,1970)。当时只有少数人有资格这样做。特别是遗传学家,不论他们对艾弗里的新发现是多么热心,也没有必需的能力。他们之中有些人缺乏研究实践这一点也不能证明他们,或至少是年轻的遗传学者,对艾弗里发现的重要意义毫不了解是有理的。
    在随后的一些年中作出重要贡献的两位研究者是恰伽夫和Andre Boivin。恰伽夫证明在任何类型的生物中腺嘌呤A和胸嘧啶T的比值以及鸟嘌呤G和胞嘧啶C的比值总是接近于1(这比值恰好是1及其分子意义显然不是恰伽夫首先发现的),A+T对G+C的比值则因生物种类不同而异。例如,在他早期研究中他发现酵母中这个比值是1.85,在结核杆菌中是0.42。Chargaff的发现彻底否定了列文的四核苷酸假说,按这一假说所有的碱的含量都应当是相同的。到了这个时候提出新的DNA分子学说的途径都已打通,时机业已成熟。后来发现恰伽夫所揭示的碱基配对(嘌呤和嘧啶)是随后解决双螺旋结构的最重要线索之一.
    应当记住有两类核酸,脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在证明它们并不分别限于动物和植物之后,它们在细胞中的作用是什么以及它们在细胞中是怎样分布的问题便提了出来。自从米歇尔那时以来就知道DNA是细胞核独有的,而且很早就有迹象表明RNA是细胞质中典型的核酸,但是究竟扩散的DNA是否也存在于细胞质中和某些RNA是否也存在于细胞核中则还有争议。这时所需要的是能运用于完整细胞并能区分DNA和RNA的新技术。换句话说,进一步的进展取决于技术上的突破。1923年细胞化学家福尔根(R.Feulgen,1884-1955)创用了一种新的染色方法(醛反应),后来称为福尔根染色,对DNA有专一性。运用这种染色方法才得以最后确证DNA只存在于细胞核中(某些细胞器中的特殊DNA除外)。后来花了更多的时间才发现了一种专一性的RNA染色反应(Brachet,1940,1941;Caspersson,1941)。通过这一反应才明确证实RNA存在于核仁和细胞质中。
    前一代的细胞学研究使我们能够对细胞核中的DNA作出定量的和定性的预测:
(1)由于染色质在每次细胞分裂中增殖(复制)后均等地分配,所以经由有丝分裂产生的一切细胞应当会有同等数量的DNA。
(2)由于减数分裂,配子DNA的含量应当是二倍体生物体细胞DNA数量的一半。
(3)根据突变相当罕见这一事实,DNA应当是非常稳定的化合物。
(4)因为在受精时两种很不相同的DNA汇集到一起,它们必须具有协调一致工作的能力。
(5)考虑到在各个层次,从局部的基因库到最高级分类单位,所观察到的遗传变异数量极其庞大,DNA必须能显示出极其大量的可能构型。
    Boivin及其同事、Vendrely兄弟(1948)创立了测定每个细胞中DNA精确含量的新方法,很快就证实了两项定量式的预测。他们证明二倍体细胞的DNA含量是单倍体的二倍。后来还发现多倍体细胞的DNA含量恰好是预期的单倍体的倍数。所有这些发现都证实DNA是和染色体结合在一起。进一步研究表明在代谢活动不同的细胞中DNA和RNA的行为也极不相同。例如即使在严格禁食的饥饿老鼠中,细胞核中DNA含量一直不变,而在这样的一些老鼠个体中RNA含量则迅速下降。“DNA的不变性是目前赋予它的特殊功能的自然结果,这功能就是作为物种遗传性状的贮存库”(Mandel et al.1948:2020-2021)。

双螺旋的发现
    在这些年的研究中对DNA的认识已经取得了长足进展,由此作出的结论往往具有预见性。例如,DNA在代谢上的惰性似乎也证实了基因理论家所普遍设想的基因是“模板”的推论:“逻辑上的结论是基因(在细胞的代谢作用中)用不着‘做’什么,它只是为合成(代谢)提供一份蓝图”(Mazia,1952:115)。DNA在数量上的绝对稳定性完全符合这一假定。
    为了回答基因怎样能够作为模板这个问题,就必须更多地了解DNA分子的结构。这一点已经被很多学者意识到,自从列文以来有些学者已经预料到DNA必定具有纵向线性结构,由脱氧核糖和磷酸(碱以某种方式与之相联)的骨架构成。需要研究的问题是这三种分子彼此是怎样联结的。只有弄清楚这个问题之后才能够确定DNA怎样执行其遗传功能。特别有三个实验室都在全力探索这个问题,当它们开始行动时应当说都具有同等的成功机会。其中一个是美国加州理工学院的鲍林(Linus Pauling)实验室。鲍林曾阐明蛋白质的
a-螺旋结构,对了解将分子键合起来的作用力曾作出重大贡献。
    另一个是伦敦皇家学院的威尔金斯(Maurice Wilkins)实验室。威尔金斯及其同事的专长是X射线结晶学,这个小组的Rosalind Franklin曾就DNA的X射线衍射(折射)图像拍摄了一些非常出色的照片。通过她的研究和其它发现引出了下面一些问题:DNA分子的骨架是直的还是扭曲成螺旋?只有一条螺旋还是两教三条?嘌呤-嘧啶碱是怎样联在骨架上的?碱是不是像瓶刷的刷毛那样联在骨架的外边?如果是两条或三条螺旋,这些碱会不会在骨架的里边,这些碱又是怎样彼此相联的?鲍林和威尔金斯小组所提出的上述问题以及其它一些问题在剑桥大学的沃森-克里克小组开始研究DNA时还都没有解决。
    这三个小组的前进步伐、错误猜想以及所遭受的许多挫折的细节用不着再来介绍,因为这些已讲得太多,也有很多精采的介绍(Olby,1974;Judson,1979)。特别值得提到的是沃森比其它研究者更清醒地认识到DNA分子在生物学中的决定性重要意义。正是这种认识,激发他百折不挠地将他的研究推向前进并取得成就,尽管他在技术上是难于完成这一任务的。威尔金斯则一直到1950年还对“核酸在细胞中究竟是干什么的”感到很奇怪。
    沃森(1928年出生)曾在美国印第安纳大学S.E.Luria指导下从事博士生研究。他在该大学和冷泉港了解到DNA的重要性,当他的某些研究计划由于技术上的原因无法进一步开展时便决定去英国从事DNA研究。在剑桥大学的卡文迪什实验室他碰上了一个性格癖好相同的人、克里克(1916年生)。克里克和沃森具有同样的才华,并且在实验技术上很内行(这是沃森所不及的),但是至少在开始时他对DNA的重要性的认识并不如沃森那样清楚。他们两人对某些方面的知识都很缺乏,然而通过与许多人交谈请教、访问有关的实验室、并无休止地采用各式各样的模型进行试验,他们终于在1953年2月和3月得到了正确的答案。DNA的各种组成分子的拚剪模型大大有助于他们弄清楚DNA分子的三维(立体)结构。
    最关键的“信息毕特”(bit of information)是恰伽夫(1950)所发现的嘌呤和嘧啶(AT和CG)的1:1比值。虽然这比值已经发现了两年,但是这三个研究小组多少都一直没有重视。当沃森和克里克最后认识到这数值关系的重要意义之后,他们只花了三个星期摆弄他们的拚剪模型就得出了DNA分子的正确结构。
    最后的结果(现在每个中学生都知道)是,DNA是一个双螺旋,两条带就像盘旋楼梯的梯级由一系列的碱基对相联。四种可能的碱基对(AT,TA,CG,GC)的顺序,正如后来很快就发现的,提供遗传信息。这信息作为装配多肰和蛋白质的蓝图从而控制细胞分化。沃森和克里克的双螺旋如此圆满地解释了一切有关事实因而几乎立即被所有的人接受,包括那两个与之激烈竞争的实验室,鲍林的和威尔金斯的实验室。这就排除了一切关于DNA是否真正是遗传物质的最后怀疑。
    茹在1883年曾认为传递遗传学的基本过程是细胞核分裂成“两个完全相同的半个”,这样措词是将重点放错了。最重要的实际上是遗传物质的倍增,然后将之分离到两个子细胞中去。因此细胞分裂中最关键的事态是DNA的精确复制。在发现双螺旋之前怎样才能做到这一点完全是一个谜。沃森和克里克一眼就看清了这一点,正像他们在原文中(相当忸怩地)所说的那样(1953a:737):“我们注意到我们所提出的特殊(碱基)配对立刻暗示了遗传物质的一种可能的复制机制。”在随后的一篇文章中他们扼要指出,螺旋解开连同嘌呤和嘧啶碱之间的键断裂产生了两个模板作为DNA的复制机制。
    了解双螺旋及其功能不仅对遗传学而且对胚胎学,生理学,进化论,甚至哲学(Delbrhck,1971)都有深刻影响。遗传型和表现型的问题现在可以用明确的语言说明,对获得性状遗传学说这是一道催命符。虽然早在1880年代和90年代就一再有人怀疑遗传物质可能和躯体的结构物质有所不同,而且即使1908年创用了“遗传型”和“表现型”这两个词,直到1944年才充分认识它们在根本上是多么不同。从1953年以后才知道遗传型的DNA本身并不进入发育途径而只不过是一套指令。1950年代分子生物学的突破和信息科学的诞生在时间上正好巧合,信息科学中的一些关键词,如程序、编码。也在分子遗传学中使用。
    编码的“遗传程序”一代又一代的经过修饰并且编入历史信息,成为了一个强有力而又为人们熟悉的概念。这一概念的历史演变还没有缕述成文。Hering(1870)和Semon(1904)的“记忆单位”(mneme)概念,虽然起初是用来支持获得性状遗传的,肯定属于这一范畴。更接近的是His(1901)将种质的活动比作讯息(message)的产生,种质活动的结果当然远比简单讯息复杂。遗传程序作为不动的运转者(Unmoved mover,Delbruck,1971)的概念是如此新颖在1940年代以前还没有人理解它。
    在全部生物学历史上还几乎没有比发现双螺旋更具有决定意义的突破。我同意Beadle的评断:“我曾经说过多次我认为研究出DNA的细致结构是20世纪中生物学的一大成就,其重要性可以和19世纪达尔文及孟德尔的成就相媲美。我这样说是因为沃森-克里克结构立刻说明了它在每一细胞世代中是怎样复制自己的,它在发育和功能中是怎样被运用并发挥作用的,它是怎样经历作为生物进化基础的突变性变化的。”
    对双螺旋的了解开拓了一个广阔的、激动人心的研究新领域而且可以毫不夸张的说由于这一发现的结果分子生物学在随后的15年中完全左右了生物学。对遗传现象真正本质的长期研究已告结束。没有解决的问题越来越多的是生理学问题,涉及基因的功能以及它在个体发生和神经生理学方面的作用。然而传递遗传学的情节已经完结。
    传递遗传学的一切发现(在第十七章 已作总结)在主要方面并没有被分子生物学的发现加以修正。值得提起的是基因细微结构的分析(Benzer发现亚单位)是由经典遗传学方法而不是生物化学方法取得的。有时能听到这样的议论,说什么由于分子生物学的新的研究路线和方法,传递遗传学已“还原”成分子遗传学。这种说法完全没有事实根据(Hull,1974)。早在1880年代就有生物学家认为基因是化学分子,大部分著名孟德尔主义者都同意这一假定。但是在1944年以前这只是一种假说。是分子生物学无可置疑的成就提供了传递遗传学有关现象的化学解释。DNA的结构(双螺旋)(1)解释了基因的线性顺序的实质,(2)表明了基因精确复制的机制,(3)按化学观点说明了突变的实质,(4)指明为什么突变、重组、功能在分子水平上是可以区分的现象。
    分子生物学对我们认识基因功能的影响更大,从而开辟了一个完全新的研究领域。将基因分为几类,如结构基因、调节基因,重复DNA等,仍然还处于初期阶段。核小体(nycleosomes)以及真核生物染色体中各种蛋白质的作用还只是粗略地有所了解。内含子、转位子(转座子)以及假想的“不活动”(silent)DNA的作用还是谜。几乎每个月都有新现象被发现同时也提出了新的疑难问题。我们知道的确实很少这一情况也许表明所有这些现象都和基因功能的调节有关。分子遗传学仍然很像一个未讲完的故事。19.4 现代观念中的遗传学
    生物学中很少有其它的分支像遗传学这样对人类的思想和人类事务具有如此深刻的影响。这是一个很大的论题难以在几页篇幅内充分讨论,我所能做的只是指出遗传学思想的某些应用。
    早就知道某些人类疾病可能是由于遗传原因,因为它们往往发生在家族之中。在维多利亚女王的男性后裔中非常流行的血友病也许是最出名的例子。18世纪Maupertuis和Reaumur就曾叙述过多指现象。到了现代已经知道人类有几百种遗传病,在很多病例中已经确定突变基因位于哪一个染色体上(McKusick,1973)。
    人类遗传学有三个方面值得特别注意。第一个是某些人类遗传病表示代谢失调。英国医生Garrod早在1902年就指出尿黑酸病是由于某一代谢途径被阻遏引起,这阻遏又是因为某种特异性酶的先天缺陷所致(另见Garrod,1909)。虽然Garrod的学说第一次发表时没有引起重视,但经Beadle和Tatum重新发现后,对生理遗传学的发展起了重要作用。
    人类遗传学的第二个重要方面是它促使遗传学家去研究那些具有某种非正规遗传方式的表现型情况。目前已经相当清楚与精神分裂病直接有关的基因或基因组具有低“外显率”,这就是说一个人尽管具有所必需的遗传素质但可能并不表现。具有低外显率的基因在果蝇中很普遍(TimofCCff-Ressovsky及Goldschmidt皆曾指出),但是由于明显的原因,遗传学者都不去研究它。有一些其它基因的表达强度是可变的(例如糖尿病基因),研究这样的基因同样可以提高对遗传方式的认识。
    也许遗传学思想对现代人影响最深远的是几乎人类的一切性状都可能有部分的遗传学基础这种认识的提高。这种看法不仅限于体质而且也包括智力或行为特征。遗传素质对人类非体质性性状(特别是智力)的影响是目前争议最多的生物学和社会学问题。
    最后,第三个方面是遗传学在动植物育种上非常重要。奶、蛋生产是动物遗传学家所取得的辉煌成就的两个例子。抗病作物的育种和杂交玉米以及短茎作物的培育是另外的例子。尽管所谓的绿色革命并不像预期的那样成功,然而它却提高了(有时甚至是激动人心的成倍增加)许多作物的产量。原始人在成千上万年过程中努力于提高作物产量所办不到的事而现代遗传学却能在十年左右的时间就能办到。
    任何一个阅读遗传学现代教科书的人都会被书中的大量事实和解释弄得茫无所措。对一个非专门家来说。即使最基础的教科书所包含的内容也不仅仅只是“你所要知道的遗传学知识”,实际上是大大超过了你所要知道的。由于现代遗传学多少已经分成三个或四个基本上独立的分支:传递遗传学(或经典遗传学),进化遗传学(或种群遗传学),分子遗传学,生理遗传学(或发育遗传学),所以情况更加严重。
    这种情况对一个想要用很少的文字来总结从1865年到1980年所进行的研究和所发表的文章中所提炼出的重要概念的思想史家来说的确是难于克服的困难。下面是我本人的尝试,不可否认这只是暂时的,以后还需要修正。
(1)最值得重视和(直到19世纪40年代)完全没有料想到的发现是遗传物质(现在知道是由DNA构成)本身并不参与新个体的躯位塑造而只是作为一个蓝图,作为一组指令,称为“遗传程序”。
(2)密码(借助于它将程序译入个体生物)在生物界是完全相同的,从最低等的微生物到最高等的动、植物。
(3)一切有性繁殖的二倍体生物的遗传程序(基因组)是成双的,由来自父本的一组指令和另一组来自母本所组成。这两个程序在正常情况下是严格同源的,共同作为一个单位起作用。
(4)程序由DNA分子构成,在真核生物中和某些蛋白质(如组蛋白)相联;这些蛋白质的详细功能还不清楚但显然协助调节不同细胞中不同基因座位的活性。
(5)由基因组的DNA到细胞质的蛋白质的代谢途径(转录与转译)是严格的单行道。躯体蛋白质不能诱发DNA中的任何变化。因此获得性状遗传在化学上是不可能的。
(6)遗传物质(DNA)从一代到下一代是完全固定不变的(硬式),除了非常罕见(百万分之一)的“突变”(即复制失误)以外。
(7)有性繁殖生物中的个体在遗传上是独特的,因为几个不同的等位基因在某个种群或物种中可能在成百上千个座位上表现。
(8)这种遗传性变异的大量储存为自然选择提供了无限的素材。

 


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