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阿瑟·科恩伯格

    1918年3月3日,阿瑟·科恩伯格(Arthur Kornberg,1918-)生于美国纽约市。他自幼聪慧过人,在初等和中等教育阶段曾3次跳级,仍然成绩优异。1937年在纽约城市学院获理学学士学位。1941年在罗切斯特大学获医学博士学位。1942年进入美国国立卫生研究院做从事研究工作。1947年,他组建了酶学研究室并任主任。1953~1959年,他应聘华盛顿大学医学院微生物学系任教授。1959年,他组建了斯坦福大学医学院生物化学系并任教授至今。他是美国科学院院士、英国皇家学会会员。半个多世纪以来,他一直活跃于生物化学研究领域,并于1965年当选为美国生物化学学会主席,但他的研究成果却对分子遗传学、基因克隆、基因测序、基因诊断以及基因组计划等现代遗传学的各个重大问题都起到了至关重要的作用。
     科恩伯格最引人注目的研究工作,是在20世纪50年代中期用实验证明DNA的复制并分离了复制所需的酶,这集中反映在他于1956年发表的著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》一文中,他因此于1959年获得诺贝尔生理学和医学奖。
     在1953年以前,基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森(J. Watson)和克里克(F. Crick)的DNA双螺旋结构模型,既反映了DNA分子可能具有的无穷多样性,又能立刻提出DNA分子自我复制的可能机制,使生物学家一下子接受基因的物质本性就是DNA。但是,DNA双螺旋结构模型虽然是以众多的实验结果为依据,但它本身却尚有待于实验证明。尤其是,DNA果真是一种能自我复制的分子吗? 在DNA双螺旋结构模型发表之后,科恩伯格就以这一模型作为设想基础,用实验方法研究DNA的复制,很快得到成功,于1956年发表了初步结果。他成功的原因之一在于他有一个正确的分析:他觉得构成DNA分子的单体虽然是4种脱氧核苷一磷酸,但是,DNA合成的原料却不是4种脱氧核苷一磷酸,而是4种脱氧核苷三磷酸。4种脱氧核苷三磷酸缺1种都不行,用4种脱氧核苷二磷酸或4种脱氧核苷一磷酸也都不行。他还设想,细胞内必有合成DNA所需的酶。于是他把大肠杆菌磨碎,用其提取液加上4种脱氧核苷三磷酸(其中至少有1种进行放射性同位素标记,以便于检查实验结果),再加一点点微量DNA作为“模板”(如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA以及大肠杆菌T2噬菌体DNA)。把上述混合液在有镁离子存在的条件下于37℃静置30min,发现放射性标记已进入DNA部分,说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子即实验产物可以用过氯沉淀法同作为原料的脱氧核苷三磷酸单体分开。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成,发现它们同各自的模板DNA组成惊人地相似, 这就充分证明新合成的DNA的特异性是由所加入的那一点点微量的模板DNA决定的,只不过数量大大增加了而已。DNA果然是一种能自我复制的分子!
     这里插叙一下,人们后来知道DNA合成还需要“引物”以提供3′端羟基,使DNA聚合酶得以从该处将一个个脱氧核苷酸聚合而成DNA。科恩伯格当年在制备模板DNA时进行了化学处理,造成了一些断裂,从而形成了一些现成的3′端羟基。这一点在当时是不知道的。科恩伯格在获得诺贝尔奖后没有止步不前。他清楚地知道,他在体外合成的DNA是没有活性的。那么,能不能在体外合成有活性的DNA分子呢?1967年,他以大肠杆菌φⅩ174噬菌体DNA为材料进行体外复制实验。φⅩ174的基因组是单链环状DNA,共5 386个核苷酸。细胞内的情况是:当φⅩ174感染大肠杆菌时,单链环状DNA进入细菌,很快就按碱基配对原则合成其互补链,构成双链环状的“复制形式DNA”。一般把噬菌体颗粒中的单链称为“+链”,进入细菌后合成的互补链称为“-链”。在细菌内复制时,是以-链为模板,按“滚环” 方式合成许多个+链。这些+链与蛋白外壳构建成新的φⅩ174从细菌内释放出来。科恩伯格基本上仍用1956年所用的方法(但增加了连接酶,使新合成链的最后一个核苷酸的3′ 端羟基和最初第一个核苷酸的5′ 端磷酸基连接起来形成环状),以φⅩ174+链DNA为模板,在体外合成-链,又以-链为模板,在体外合成+链。体外合成的φⅩ174+链DNA能感染大肠杆菌,在细菌内能复制,最后从细菌内释放出许多φⅩ174噬菌体颗粒,具有原来φⅩ174噬菌体的全部特性。由此,人类首次在试管内合成了具有生物学活性的DNA分子。 科恩伯格在DNA体外合成方面所取得的成就,其影响极为深远。首先是关于DNA复制所需的酶。
     科恩伯格开始实验时所设想的大肠杆菌提取液中含有的DNA聚合酶,在1957年就被他分离纯化,那就是至今仍在全世界各个分子遗传学实验室里经常使用的“大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ”,又称“科恩伯格酶”。它既具有聚合酶的活性,又具有5′→3′ 外切酶和3′→5′外切酶的活性。今天我们用DNA分子杂交技术进行基因分离、基因结构分析、基因诊断等研究时要用放射性同位素标记的基因探针;标记基因探针常用的“缺刻前移法”(nick translation)就是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ兼有聚合酶活性和5′→3′ 外切酶活性这一特点,而其反应过程也就是科恩伯格当年进行的DNA体外合成的过程。所以,尽管后来证明在大肠杆菌细胞内复制时起主要聚合作用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ,不是DNA聚合酶Ⅰ,但在分子遗传学实验室里,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的重要性却处于实验室常用酶的最前列。
 1970年,丹麦生物化学家克莱诺夫(H.Klenow)用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,电泳后获得大小两个片段。大片段保留了聚合酶和3′→5′外切酶活性,但丧失了5′→3′ 外切酶活性,被称为“克莱诺夫片段”,又称“克莱诺夫酶”。标记基因探针常用的另一种“随机引物法”(random priming)就必须用克莱诺夫酶而不能用科恩伯格酶。其次,科恩伯格的成就还直接导致了一些诺贝尔奖的获奖项目。
     到目前为止,包括2003年4月完成的“人基因组计划” 在内,已有超过1000种的噬菌体、病毒、类病毒、细菌、原始细菌、真菌、植物、动物以及细胞器和质粒的基因组DNA全核苷酸序列被测定。DNA测序起始于英国生物化学家桑格(F. Sanger)在1975年建立的“加减法”以及他用该法在1977年首次测定了φⅩ174基因组DNA的全核苷酸序列。近30年来,DNA测序由半自动化发展到全部由仪器自动测序,但其基本原理仍然没有跳出桑格“加减法” 的范畴,而“加减法” 的“源头” 则是科恩伯格的DNA体外合成实验。它是设法控制DNA酶促合成反应,使之产生不同长度的互补链,从而测定一个一个核苷酸的排列顺序。其中, 所用的DNA聚合酶正是克莱诺夫酶。桑格因建立DNA测序方法而获得1980年诺贝尔化学奖。
     1985年,美国生物化学家马利斯(K.B. Mullis)建立了“聚合酶链反应”(polymerase chain reaction, PCR)技术,很快成为进行基因克隆、基因定位、DNA测序、DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测、古DNA分析、法医DNA鉴定等等领域中应用最为广泛的分子遗传学实验技术,马利斯也因此获得1993年诺贝尔化学奖。从原理上说,PCR简直就是科恩伯格DNA体外合成实验的直接延伸。马利斯只是把DNA体外合成的过程循环进行多次,也就是说,按“高温使模板DNA变性→低温使引物与模板DNA复性→中温使引物按模板DNA互补延伸” 这样3个步骤循环20~30次,一个DNA分子就能扩增至几十万甚至几百万份拷贝。PCR完成的DNA体外扩增实质上就是循环多次的DNA体外合成。马利斯开始所用的DNA聚合酶也是克莱诺夫酶,但它经受高温后会丧失活性,所以每次循环都要添加;1987年后才改用耐热的TaqDNA聚合酶。说PCR是由早它30年的科恩伯格实验衍生而来,是一点不过份的。
     科恩伯格的主要专著有:《DNA合成》(1974);《DNA复制》(1980);《DNA复制-增补版》(1982);《DNA复制-第2版》(1992);《黄金螺旋:走进生物技术的探险之路》(1995)。1989年,他出版了自传《为了对酶的爱: 一个生物化学家的毕生探索之路》。
     科恩伯格于1943年与西尔维·鲁思·利维(Sylvy Ruth Levy)结婚,生有3子。长子罗杰·戴维·科恩伯格(Roger David Kornberg, 1947-)是斯坦福大学结构生物学教授,在建立染色质基本结构的核小体模型中起了关键作用。次子托马斯·比尔·科恩伯格(Thomas Bill Kornberg, 1948-)是旧金山加州大学生物化学教授。幼子肯尼思·安德鲁·科恩伯格(Kenneth Andrew Kornberg, 1950-)是专长于实验室设计的建筑师。1986年西尔维夫人去世。科恩伯格于1988年与查伦·沃尔什·莱弗林(Charlene Walsh Levering )结婚。查伦夫人于1995 去世。他又于1998 年与卡罗林·弗雷·狄克逊(Carolyn Frey Dixon)结婚。科恩伯格定居于美国加州波尔塔拉谷。他喜欢网球、旅游、音乐、以及与家人在一起的时刻。


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